Theses
Below please find the PhD theses that have been presented at the Neurobiology Unit since 1971.
To go directly to a specific year please click on the year here: 2012, 2009, 2008, 2007, 2005, 2004, 2003, 2002, 2001, 1999, 1997, 1996, 1995, 1994, 1993, 1991, 1990, 1988, 1987, 1984, 1981, 1980, 1979, 1975, 1974, 1973, 1971
Shane Grealish: Cell Replacement Therapy for Parkinson's Disease: The Importance of Neuronal Subtype, Cell Source and Connectivity for Functional Recovery.
Supervisor: Anders Björklund, Malin Parmar, Lachlan Thompson
Department: Experimental Medical Science
Date of defense: 2012-01-27
Place of defense: Segerfalsalen, Wallenberg Neuroscience Center, Lund
Opponent: Prof. Jeffrey Macklis
Date of publication: 2012
No of pages: 180
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN: 978-91-86871-66-6 / ISSN: 1652-8220
Summary
Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterised by motor deficits such as slowness in movement, difficulty in initiating movement and tremor at rest. The cause of these motor symptoms is the selective loss of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons, located in the substantia nigra (SN). These neurons project axons to the striatum where they release dopamine, a neurotransmitter that controls voluntary movement. Current drug treatments restore the lost dopamine, while initially efficacious, the beneficial effects wear off resulting in severe side effects. Thus, there is a clear requirement for alternative therapeutic options.
One such idea is cell replacement therapy (CRT). CRT aims to replace neurons that have degenerated in PD, with donor cells that have the potential to functionally re-integrate into the host circuitry. This involves transplantation of developing midbrain cells from aborted fetuses, (the part that form mesDA neurons), into the striatum of a PD patient. Clinical trials have demonstrated that CRT can provide long-lasting, significant clinical benefit. Although some patients do not respond as favourably. We still do not know what specific factors contribute to the success in transplantation i.e. what cells are responsible for motor recovery? Can the transplants reform damaged neuronal circuitry? Use of human fetal tissue raises several ethical issues, but are there alternative cell sources that can substitute effectively? The aim of this thesis was to understand how particular factors such as neuronal content, placement and cell source, affect functional outcome after transplantation into the rodent brain.
In paper №1, I detail the neurodegenerative and behavioural outcomes in a mouse lesion model of PD, which can be used as a platform for the development of novel therapeutic strategies. I also describe the development of a novel behavioural task that is predictive of mesDA neuron cell loss in mice. Previously, it was thought that transplanted neurons could not extend axons over long distances rendering transplantation into the SN a non-viable approach. In paper №2, I describe how mesDA neurons transplanted in the adult SN of a PD mouse model, extended axons across millimetres into the striatum, functionally reforming the nigrostriatal pathway. In paper №3, I also identify the specific mesDA population (A9) that is critical for functional recovery, with transplants that lack A9 neurons failing to improve motor recovery. A potentially pre-clinical aspect of this thesis is detailed in paper №4 where I describe a robust protocol for the generation of functional mesDA neurons from human embryonic stem cells that are functional in a rat model of PD. No evidence of tumour formation was observed in the transplanted animals, a major concern when utilising a pluripotent cell source.
Through understanding functional recovery in terms of neuronal subtype and connectivity, the work presented in this thesis aims to bring the prospect of CRT closer to the clinic, I also describe the generation of a very promising alternative cell source that could rival fetal tissue. Together this work contributes to making CRT a reality for the treatment of PD.
2009
Marie Jönsson: Identification of dopamine neuron progenitors in the embryonic midbrain and stem cell cultures
Supervisor: Anders Björklund and Malin Parmar
Department: Experimental Medical Science
Date of Defense: October 30th 2009
Place of Defense: Segerfalksalen, Wallenberg Neuroscience Center, Lund, Sweden
Opponent: Prof. Ernest Arenas
Date of publication: 2009
No of pages: 124
Type of ducument: PhD thesis
Language: English
ISBN: 978-91-86253-85-1 / ISSN: 1652-8220
English summary
Parkinson's Disease is a neurodegenerative disorder where the dopamine producing neurons in the ventral mesencephalon (VM) progressively die and result in symptoms such as resting tremors, muscle rigidity, slowness and difficulties in initiating movements. Currently there is no cure for PD and the available drug treatments only offer symptomatic relief and are often associated with severe side effects. Thus, there is an obvious need for alternative therapies.
A promising alternative approach is cell replacement therapy, which aims to replace the lost dopamine-producing neurons by transplanting cells with equivalent properties. Clinical transplantations using cells obtained from foetal VM tissue have provided the proof-of-principle that cell replacement therapy can provide a long-lasting recovery. However, the use of foetal tissue involves moral and severe practical issues making it impossible to standardise the required quantity and quality of cells. In the context of developing an alternative cell source that can offer a consistent and expandable supply of mesDA neuron progenitors, this thesis has investigated the features of foetal VM cells that allow them to survive, innervate and function upon transplantation.
The foetal VM tissue obtained for transplantation contains mesDA neuron progenitors at different differentiation states. By identifying and isolation the mesDA neuron progenitors from different developmental time points and differentiation states, the work in this thesis has shown that the optimal differentiation state for transplantation changes from a proliferative to postmitotic progenitor during development. It is crucial that the mesDA progenitors are harvested within this window of opportunity for the cells to survive, integrate and function upon transplantation. Following transplantation, the foetal VM was shown to give rise to the main mesDA neuron subtypes of the VM, namely A9 and A10. Furthermore the data in this demonstrates that a functional graft is explicitly dependent on the generation of A9 neurons, which were shown to be necessary for innervation and connection with the host tissue.
The knowledge obtained from the work with foetal VM was applied to embryonic stem (ES) cells as the alternative cell source. ES cells posses the feature of being renewable and have the potential to generate mesDS neurons. However, differentiating ES cell cultures also contain other cell types as well as immature cells, which frequently give rise to tumour-like structures within the grafts. The approach of identifying and isolating the ES cell derived mesDA progenitors prior to transplantation resulted in grafts enriched with mesDA neurons without the concomitant tumour-like growths.
The goal of obtaining a safe and alternative cell source for PD cell replacement therapy has been brought closer with the work presented in this thesis. The use of stem cells is unquestionably promising and may one day be a reality in the clinical treatment of PD patients.
2008
Josephine Hebsgaard: Generation of cells for cell-replacement therapy: Specification of neural precursors in vivo and in neural stem cell cultures
Supervisor: Anders Björklund and Malin Parmar
Department: Experimental Medical Science
Date of defense: March 14th 2008
Place of defense: Segerfalkroom, Wallenberg Neuroscience Center, Lund
Opponent: Prof. Gord Fishell
Date of publication: 2008
No of pages: 136
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN:978-91-85897-74-2 / ISSN: 1652-8220
Summary
Cell replacement therapy of neurodegenerative disorders aims to substitute the degenerating cells with new functional neurons. Clinical trails with patients suffering from Parkinson’s or Huntington’s disease have generated proof-of-principle results that neural precursors taken from the developing human brain can survive upon grafting to the diseased brain and provide long-lasting symptomatic relief. However, further development of this type of therapy critically depends on the generation of an unlimited and standardized source of neural precursors that after transplantation differentiate into the proper neuronal subtypes. This requires knowledge on the molecular mechanisms responsible for the specification of neurons during development, and how cells with the potential for regional specific neuronal differentiation can be expanded in culture. The work of this thesis has focused on the role of the proneural gene Neurogenin2 in specification of the midbrain dopaminergic (mesDA) neurons, the cell population that degenerate in Parkinson’s disease. Additionally, we have studied to what extent neural stem cells isolated from the developing brain and expanded under growth-factor stimulation in culture maintain their regional specification. We show that Neurogenin2 is required in vivo for proper development of the mesDA neuron system, more specifically for the immature mesDA neuron precursors to adopt a neuronal fate. Furthermore, we successfully applied a new culture system for expansion of neural stem cells, the neural stem cell (NS cell) cultures, to neural precursors from different regions of the developing brain. We showed that even after extensive expansion cells in the NS cell cultures retain their capacity to form neurons. Furthermore, the expanded cells harbor regional differences in their growth properties and to some extend in their gene expression profile. This show that the NS cell culture is an attractive alternative to the traditionally and more commonly used neurosphere culture system for expansion of fetal neural stem cells. Unfortunately, our investigations also showed that neither in the neurosphere nor in the NS cell culture system cells with the characteristic of mesDA neuron precursors are expandable. These results are valuable for further progression in neural stem cell research and particular for improvement of the existing protocols for generating mesDA neurons from expanded neural stem cells.
2007
Thomas Carlsson: Cell and Gene Therapy for Parkinson's Diesase: Therapeutic Effect and Modulation of Dyskinesias in the 6-OHDA Rat Model
Supervisor: Anders Björklund / Deniz Kirik
Department: Experimental Medical Science
Date of Defense: June 14th 2007
Place of Defense: Segerfalksalen, Wallenberg Neuroscience Center, Lund, Sweden
Opponent: Associate Professor Un Jung Kang
Date of Publication: 2007
No of pages: 164
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISSN: 1652-8220 / ISBN: 978-91-85559-90-9
English Summary
The main pathological feature in Parkinson?s disease is the progressive loss of dopamine neurons in the midbrain, which in turn leads to the appearance of motor deficits such as akinesia/bradykinesia (loss/slowness of movements), rigidity, postural imbalance and tremor. To this day, there is no cure for the disease, but there are medications to relieve the symptoms. The gold standard medication is the administration of the precursor of dopamine, L-DOPA, which is very efficient within the first years. Unfortunately, for the majority of the patients, this medication later leads to the development of abnormal involuntary movements, termed dyskinesias. These L-DOPA-induced dyskinesias are suggested to develop due to the route of the oral administration of the medication, which gives rise to intermittent and high fluctuations in the brain dopamine levels. Support for this has come from studies showing that continuous delivery of L-DOPA decreases the severity and magnitude of these side effects. In order to restore lost dopamine circuitry, fetal cell transplantation has been investigated as a potential treatment. The outcome of clinical trials has been highly variable, where some patients have shown very good response, while others displayed only marginal improvements to even a worsening of the L-DOPA-induced side effects. In addition, some patients have also experienced a new type of graft-induced dyskinesias in absence of any L-DOPA medication. In this thesis work, I have investigated the role of the progressive neurodegeneration on the functional improvement, as well as the development and maintenance of L-DOPA- and graft-induced dyskinesias, after fetal cell transplantation in the 6-hydroxydopamine rat model of Parkinson?s disease. Dyskinesias, in particular, have been studied in regard to graft placement and the role of the serotonin neurons in the graft as well as the role of the host serotonin system. In addition, I have investigated if continuous delivery of DOPA (endogenous L-DOPA) by viral vector-mediated gene transfer, of the dopamine-dependent enzymes tyrosine hydroxylase and GTP cyclohydrolase 1, can reverse L-DOPA-induced dyskinesias. The results demonstrate that progression of the DA lesion outside striatal areas can be detrimental for the functional impact of the fetal cell transplantation. Moreover, the location of the transplanted neurons in the striatum, and the presence of serotonin neurons in the grafted tissue may have an impact on development and maintenance of L-DOPA-induced dyskinesias. Finally, viral vector gene delivery strategy to replace DOPA in the striatum can effectively improve behavior function and reduce L-DOPA-induced dyskinesia in the rat model of Parkinson's disease. This novel gene therapy treatment hold great promise for future clinical applications.
Swedish Summary
Parkinsons sjukdom uppstår när celler som producerar signalsubstansen dopamin i hjärnan dör. Detta leder till att de drabbade patienterna blir stela, får långsamma rörelser, svårt att påbörja och avsluta rörelser och även skakningar i framförallt armar och händer. Idag finns inget sätt att bota sjukdomen. Dock finns det läkemedel som kan lindra symptomen. Den vanligaste medicinen är L-DOPA, vilket är en molekyl som kan omvandlas till dopamin i hjärnan. Denna behandling fungerar bra under de första 5-10 åren efter det att sjukdomen diagnostiserats. Dock, tyvärr, ju längre sjukdomen pågår, desto mindre effekt har L-DOPA medicineringen och många patienter utvecklar biverkningar som yttrar sig som okontrollerade och onormala rörelser, så kallade dyskinesier. En behandlingsmetod som har utvärderats för att bota och/eller lindra symptomen är transplantationer av dopaminceller från fostervävnad. Dessa studier har visat goda resultat hos vissa patienter men effekten av transplantaten har varit mycket varierande, och några patienter har utvecklat bevärande dyskinesier. I min avhandling har jag framförallt fokuserat mig på att undersöka uppkomsten av de ofrivilliga rörelserna, dyskinesierna, och effekten av celltransplantationer på dessa dyskinesier in en råttmodell av Parkinsons sjukdom. Målet är att klarlägga vilka faktorer som påverkar utvecklingen av dyskinesier och vad som leder till de stora skillnader man sett mellan olika patienter. Vidare har jag studerat en ny genterapiteknik som bygger på att överuttrycka de gener som styr dopaminproduktionen i hjärnan, och utvärderat denna behandlingsmetods inverkan på dyskinesierna. Resultaten visar att transplantationer av fostercellsvävnad troligen ger bäst resultat när patienterna inte har en alltför långt framskriden sjukdom. Vidare är placeringen av cellerna i hjärnan och vilka typer av celler som transplanteras mycket viktiga för hur bra de kan motverka bieffekterna som uppkommer från L-DOPA-behandlingen. Vi visar också att celler som producerar signalsubstansen serotonin är en viktig faktor för uppkomsten av dyskinesier. Detta innefattar både hjärnans egna serotoninsystem men också de serotoninceller som finns i den transplanterade vävnaden. Slutligen, genterapi för lokal kontinuerlig produktion av L-DOPA direkt i hjärnan visar mycket lovande resultat, både en markant förbättring av den motoriska funktionen och en effektiv blockering av de L-DOPA-inducerade dyskinesierna.
2005
Elin Andersson: Generation of midbrain dopaminergic neurons in vivo and in vitro: the role of Neurogenin2
Supervisor: Anders Björklund
Department: Experimental Medical Science
Date of defense: December 17th 2005
Place of defense: Segerfalksalen, Wallenberg Neurosciencecenter, Lund, Sweden
Opponent: Professor Thomas Perlmann
Date of publication: 2005
No of pages: 176
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN: 91-85439-09-6
English summary
Parkinsons disease (PD) is a neurodegenerative disorder where dopaminergic neurons of the substantia nigra (SNc) in the mesencephalon are progressively eliminated. The ensuing loss of dopaminergic innervation of the basal ganglia manifests itself as severe motor deficits in PD patients. Clinical trials have shown that cell replacement therapy, where dopaminergic neuroblasts derived from fetal ventral mesencephalon (VM) are transplanted to the striatum, may be an alternative to pharmacological treatment of PD patients. The limited access and ethical concerns with using fetal tissue have prompted the use of stem cells as a renewable and limitless source of dopaminergic neurons. However, the mechanisms of specification of mesDA neurons in vivo need to be elucidated for identification and generation of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons from stem cells in vitro. In this thesis I have identified expression of the proneural gene Neurogenin2 (Ngn2) in a restricted pattern in the embryonic VM during mesDA neurogenesis. The protein was expressed in the progenitor population in the ventricular zone but not in mature neurons in the mantle zone. When isolating the Ngn2-expressing cells and their direct descendants by FACS from an Ngn2-GFP-KI mouse, I found that the Ngn2-GFP-positive cell fraction contained dopaminergic neurons, in contrast to Ngn2-GFP-negative cells. This shows that Ngn2 label early mesDA neuron precursors. Furthermore, when I analysed the Ngn2 knockout mutants, I found that they displayed an early loss of mesDA neurons that was partially maintained at postnatal stages, showing that Ngn2 has a role in the generation of the mesDA neurons. No other neuronal subtype in the VM was affected suggesting that this role for Ngn2 is specific for the mesDA neurons. Using embryonic mouse tissue obtained at the stage of mesDA genesis, I was able to generate cultures of neural stem and progenitor cells, so called neurosphere cultures, that were neurogenic and maintained a ventral midbrain character over several passages. Although the neurospheres did not spontaneously give rise to dopaminergic neurons when differentiated, TH-positive cells were detected when Nurr1 was over-expressed in the cultures. The frequency with which this occurred, and the morphology of the TH-positive cells, differed from the results obtained when over-expressing Nurr1 in forebrain-derived expanded cells. This suggests that neurosphere expanded cells derived from VM specifically contain progenitors that can generate dopaminergic neurons under certain conditions. When over- expressing Ngn2 together with Nurr1 TH-positive cells were generated that displayed a mature neuronal morphology. Furthermore, I found that they expressed other dopaminergic markers which were not seen when either Nurr1 or Ngn2 were over-expressed alone. This suggests that Nurr1 and Ngn2 interact to specify a more mature dopaminergic phenotype. The results in this thesis have identified a new cellular marker of mesDA progenitors in the developing embryo and also provided new insight into the development of mesDA neurons.
Swedish summary
I hjärnan finns många olika typer av nervceller. De använder sig av olika signalsubstanser, kallade neurotransmittorer, för att kommunicera med andra nervceller. En viss typ av nervceller använder neurotransmittorn dopamin. Dopaminceller finns på många ställen i hjärnan men de flesta ligger i mellanhjärnan i ett par olika cellgrupper som var och en skickar signaler till sina specifika områden i andra delar av hjärnan. En av dessa cellgrupper kallas substantia nigra och signalerar till ställen som styr en människas motorik. Hos patienter med Parkinsons sjukdom, dör cellerna i denna grupp och då försvinner även dopaminsignalerna till de delar som styr motoriska förmågor. Därför har Parkinson-patienter typiska symptom, som problem med motoriken och svårighet att sätta igång rörelser. För att lindra dessa symptom kan Parkinsonpatienter ta medicin som ska ersätta dopaminet. Man har också testat andra behandlingsmetoder som går ut på att ersätta dopamincellerna inuti hjärnan. Genom att ta dopaminceller från fostervävnad och transplantera till hjärnan har man lyckats återskapa dopaminsignalleringen utan mediciner. Tyvärr kan denna teknik ännu inte tillämpas på många patienter eftersom det är svårt att få tag på tillräckligt mycket vävnad. Man har därför börjat undersöka hur man kan generera dopaminceller på annat sätt. En metod är att använda stamceller, celler som kan förökas i kultur och som kan utvecklas till vilka sorters celler som helst. För att få stamcellerna att bli dopaminceller så måste man veta vad det är som gör att just den sortens nervceller bildas. Vi måste förstå vilka de bakomliggande faktorerna är som styr cellutvecklingen mot dopaminceller. I min avhandling har jag undersökt vilka signaler och gener som är viktiga för att dopaminceller ska bildas. För att ta reda på det har jag tittat på dopaminceller under fosterutvecklingen. I mina studier använde jag möss som en modell för vad som händer i människan. Jag fann att en gen, Neurogenin2, var påslagen (uttryckt) i precis de celler som skulle bli dopaminceller hos mössfoster. När jag sedan undersökte muterade möss där denna gen var borttagen såg jag att dopamincellerna i mellanhjärnan inte bildades som de skulle. Detta visar att Neurogenin2 är viktig för bildandet av dopaminceller. Jag försökte också påverka odlade stamceller att utvecklas till dopaminceller genom att se till att Neurogenin2 uttrycktes i cellerna. När jag uttryckte Neurogenin2 tillsammans med en annan gen, Nurr1, som också är viktig för att det ska bli dopaminceller, gav det bättre resultat än att använda dem var och en för sig och jag såg att det bildades dopaminceller i cellkulturerna. Med resultaten som presenteras i den här avhandlingen har vi kommit ännu en bit på väg för att veta hur dopaminceller genereras. Mina resultat kan användas bl.a för att identifiera celler som ska bli dopaminceller. I ett längre perspektiv kan mina resultat bidra till att man kan generera dopaminceller från stamceller och därmed ge de patienter som lider av Parkinsons sjukdom en alternativ behandling.
2004
Biljana Georgievska: GDNF gene delivery in an animal model of Parkinson's disease. Long-term effects on intact, injured and transplanted dopamine neurons using lentiviral gene transfer
Supervisor: Anders Björklund
Department: Experimental Medical Science
Date of defense: May 7th, 2004
Place of defense: Segerfalksalen, Wallenberg Neuroscience Center
Opponent: Prof Ole Isacson
Date of publication: 2004
No of pages: 176
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN: 91-628-6038-0
English summary
Parkinson's disease is characterized by a progressive degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra, leading to a loss of dopamine in the target structure striatum and development of motor symptoms, such as bradykinesia, rigidity and tremor. New experimental treatment strategies for Parkinson's disease are aimed at either preventing the degeneration of the dopaminergic neurons, or at restoring dopamine in the striatum by fetal dopaminergic transplants. In this thesis work, we have evaluated the long-term effects of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) on intact, injured and transplanted dopaminergic neurons following GDNF gene delivery using a viral vector system based on lentiviruses. The results show that the lentiviral vectors provide an efficient transfer of the GDNF gene into the nigrostriatal dopamine system, resulting in a stable and long-lasting expression of the GDNF protein at high levels. The neuroprotective effects of lentiviral-mediated delivery of GDNF were evaluated in a rat model of Parkinson's disease and demonstrated that continuous overexpression of GDNF in the striatum provided an efficient protection of the nigral dopamine neurons, however, improvements in motor function were not observed. Instead, GDNF induced an aberrant sprouting of nigrostriatal fibers in areas outside of the striatum, and the phenotypic expression of tyrosine hydroxylase was reduced in the preserved dopaminergic terminals. We further evaluated the GDNF-induced downregulation of tyrosine hydroxylase in the intact nigrostriatal dopamine system and showed that this effect was both time- and dose-dependent, and did not seem to have a detrimental effect on normal dopamine neurotransmission. The lentiviral vector was also used to study the long-term effects of GDNF on the survival and function of transplanted fetal dopamine neurons. GDNF initially increased the survival of the grafted dopamine neurons, however, the protected cells failed to survive long-term and the presence of GDNF around the grafts appeared to be detrimental to the transplant-induced recovery in these animals. Based on the observation that long-term and continuous GDNF delivery may have compromising effects on the functional outcome in either a neuroprotective or restorative paradigm, we developed a regulatable lentiviral vector system for controlled expression of GDNF in the rat brain. Efficient induction of GDNF gene expression was obtained following injection of the regulated lentiviral vector into the striatum, however, a significant basal expression was also observed, demonstrating the need to further improve the vector system for tight regulation in vivo. The findings of this thesis will have implications for the development of a GDNF gene therapy approach in Parkinson's disease.
Swedish summary
Parkinsons sjukdom är en av de vanligaste neurodegenerativa sjukdomarna och orsakas av en selektiv förlust av dopaminerga neuron i mellanhjärnans substantia nigra (SN). Detta leder till en minskad mängd dopamin (DA) i hjärnans motoriska centrum, striatum, vilket orsakar de karakteristiska symptomen bradykinesi, muskelrigiditet och tremor. Förlusten av DA neuron i SN sker successivt över flera år och de första symptomen uppträder när ungefär 50% av neuronen har dött. Den huvudsakliga behandlingen idag är baserad på att kompensera dopaminbristen i striatum genom tillförsel av L-DOPA, som i hjärnan omvandlas till DA. Denna behandling motverkar symptomen, men förhindrar inte den fortsatta degenerationen av DA neuron i SN. Det progressiva förloppet i Parkinsons sjukdom ger oss möjligheter att förhindra den pågående degenerativa processen och skydda de kvarvarande cellerna. Den neurotrofa faktorn GDNF är särskilt intressant med tanke på dess effektivitet, vilken har demonstrerats i flera djurmodeller av Parkinsons sjukdom. Med tanke på det kroniska och progressiva förloppet vid Parkinsons sjukdom, är det troligt att GDNF behöver administreras kontinuerligt, över månader eller år, för att åstadkomma överlevnad och förbättrad funktion långsiktigt. Detta kan uppnås med hjälp av genterapi, vilket innebär transfer av genen för GDNF till hjärnan med hjälp av virala genbärare, så kallade vektorer. I denna avhandling har jag använt virala vektorer baserade på lentivirus för att studera de långvariga effekterna av kontinuerligt GDNF uttryck på normala, skadade eller transplanterade DA neuron. Resultaten visar att GDNF gentransfer till det nigrostriatala DA systemet effektivt kan motverka förlusten av DA neuron i djur med experimentellt inducerad parkinsonism, men att det långvariga uttrycket av GDNF kan ha funktionellt negativa effekter i dessa djur. GDNF kan också orsaka en kraftig nedreglering av tyrosinhydroxylas (TH), det hastighetsbestämmande enzymet i DA syntesen, i de skyddade DA neuronen. Den GDNF-inducerade nedregleringen av TH enzymet uppkommer även i det intakta DA systemet, men verkar inte orsaka några negativa effekter på den normala DA transmissionen. Kontinuerligt uttryck av GDNF kan kortsiktigt öka överlevnaden av fetala DA neuron efter transplantation till det denerverade striatum, men den funktionella effekten av transplantaten är försämrad i de GDNF- behandlade djuren. Baserat på dessa observationer, har jag i mitt avhandlingsarbete även försökt att utveckla ett lentiviralt vektorsystem som möjliggör en reglering av GDNF utrycket. Den kliniska appliceringen av GDNF genterapi med hjälp av virala vektorer kan endast genomföras när metoden har bevisats vara ofarlig. Fler experimentella studier behöver genomföras i djurmodeller av Parkinsons sjukdom för att fastslå den biologiskt relevanta dosen av GDNF som behöver uttryckas för att uppnå en positiv effekt, samt utvecklandet av vektor konstrukt som tillåter en effektiv reglering av genuttrycket, med möjlighet att stänga av uttrycket helt vid uppkomst av negativa effekter av GDNF behandlingen.
2003
Cecilia Eriksson: Neuronal and glial differentiation of expanded neural stem and progenitor cells; in vitro and after transplantation
Supervisor: Anders Björklund
Department: Experimental Medical Science
Date of defense: May 27th 2003
Place of defense: Segerfalkssalen, Wallenberg Neuroscience Center, Lund, Sweden
Opponent: Professor Clive N Svendsen
Date of publication: 2003
No of pages: 151
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN: 91-628-5666-9
English summary
In this thesis we have used cells dissected from the lateral ganglionic eminence (LGE), the medial ganglionic eminence (MGE), and the cortical primordium of the embryonic mouse forebrain. The tissue was dissected from either i) wild-type mice, ii) green fluorescent protein (GFP)-, or iii) Gtv-a-expressing transgenic mice, and subsequently grown and expanded in vitro using two different protocols. Cells were either plated and extensively expanded as attached glial cultures in the presence of epidermal growth factor (EGF) and serum, or expanded in the presence of EGF and basic fibroblast growth factor (bFGF) as free-floating aggregates termed neurospheres. The attached LGE-derived cells were expanded for more that 7 months (25 passages), and the cells expressed neural stem-/progenitor markers, such as glial fibrillary acidic protein (GFAP), nestin, RC2 and M2/M6, both at early and late passages. We demonstrated that the repeatedly passaged attached glial cultures derived from either the LGE or MGE (but not the cortical primordium) were capable of generating significant numbers of neurons and glial cells at differentiating conditions, i.e. after removal of EGF and serum from the expansion medium. By using a transgenic approach, we were able to show that at least a subset of the newly generated neurons and oligodendrocytes were derived from GFAP-expressing cells. Interestingly, the newly generated neurons were found to retain some of their region-specific expression even after extensive in vitro-expansion. After grafting of the expanded attached LGE-derived cells, we found that they were able to integrate into both the adult (intact and lesioned) and neonatal rat striatum, as visualized with the mouse-specific astroglial marker M2. However, even though these cells had the capacity to differentiate into neurons and glial cells in vitro, we were only able to detect few neuron-like cells after transplantation. Instead these cells expressed almost exclusively an astroglial phenotype after implantation. Moreover, we showed that cells from expanded neurosphere cultures, derived from the LGE, MGE and cortical primordium of the embryonic GFP-transgenic mouse, had the capacity to differentiate into morphologically fully mature neurons, as well as astrocytes and oligodendrocytes after transplantation, as visualized with the species-specific marker M2 and the reporter gene GFP. These results demonstrated the ability of mouse derived neural stem-/progenitor cells expanded in vitro as neurospheres to generate both neurons and glia after transplantation into neonatal recipients, and differentiate into mature neurons with morphological features characteristic for each target site. Altogether, the results of the present thesis demonstrate a capacity of cells derived from the mouse embryonic forebrain to be long-term expanded using two different protocols, and that the cells have the potential to differentiate in vitro and give rise to progeny with at least some region-specific characteristics retained. The cells can also survive and integrate into the host tissue after transplantation. However, mainly cells grown as neurospheres displayed the potential of neuronal differentiation after implantation into the neonatal graft host. A lot of experimental work is still needed in order to understand and control the mechanisms for growth and differentiation of neural stem-/progenitor cells before such cells can be applied in other studies, such as in clinical trials towards treatment of for example neurodegenerative disorders.
Swedish summary
Denna avhandling handlar om stam- och progenitorceller från den embryonala mushjärnan. Jag har studerat dessa cellers förmåga att växa in vitro (utanför kroppen) samt efter transplantation till hjärnan hos vuxna och nyfödda råttor. Forskning om stamceller har länge varit ett populärt och uppmärksammat forskningsområde, men under de senaste åren har intresset i det närmaste eskalerat. Vad är då stamceller? Jo, stamceller är multipotenta celler med kapacitet att dela sig och ge upphov till olika celler inom den vävnad de befinner sig i. Stamcellerna i hjärnan kan dela sig på två olika sätt. Dels genom symmetrisk celldelning då de ger upphov till två nya identiska kopior, samt asymmetriskt då en identisk stamcell och en dottercell med ett förutbestämt öde bildas. Dottercellen kallas för progenitorcell och är en något mer specificerad cell jämfört med en stamcell. Progenitorcellerna i hjärnan kan dela sig under en kort tidsperiod för att ge upphov till antingen en nervcell eller en stödjecell, sk gliacell. Gliaceller är ett begrepp i det centrala nervsystemet som innefattar astrocyter, oligodendrocyter, mikroglia och ependymalceller. I den embryonala hjärnan befinner sig stamcellerna i ett område runt ventrikeln som benämns ventrikulärzonen. Här delar sig stamcellerna och ger upphov till respektive progenitorcell. När progenitorcellerna har genomgått sin sista celldelning, migrerar de ut i hjärnan till den plats där utmognad till en funktionell cell sker. Inom fältet diskuteras mycket kring vilken cell i hjärnan som är den sanna stamcellen och nyligen presenterades data från olika forskargrupper som föreslår att det är den så kallade radialgliacellen som är den egentliga stamcellen. Denna celltyp finns bara under embryots utveckling och har en specifik bipolär morfologi med cellkroppen belägen i ventrikulärzonen och ett radialutskott som sträcker sig nedåt mot ventrikeln, samt ett uppåt mot hjärnhinnan. Radialgliaceller uttrycker vissa specifika markörer, både kända stam-/progenitorcellmarkörer och gliamarkörer. Radialgliacellerna delar sig under hjärnas utvecklingsfas och ger då upphov till nervceller under nervcellsbildningen (neurogenesen), vilken sker tidigt i hjärnans utveckling. Dessa celler låter även nybildade nervceller klättra på radialutskotten till sina platser ute hjärnbarken. När neurogenesen är över, delar sig radialgliacellerna en sista gång för att ge upphov till astrocyter. Trots tidigare hypoteser om att neurogenesen avtar efter födseln, har det på senare år visat sig att nybildning av nervceller sker i specifika regioner av den vuxna hjärnan. Dessa nybildade celler tros härröra från stamceller i den vuxna hjärnan som föreslagits vara GFAP (glial fibrillary acidic protein)-uttryckande astrocyter. Ett mål med stamcellsforskning är att studera och lära känna dessa celler så pass väl, att det finns en möjlighet att i framtiden eventuellt kunna använda stam-/progenitorceller vid tex transplantationer till patienter med neurodegenerativa sjukdomar. Stamceller skulle då på olika sätt kunna fungera terapeutiskt, dels genom att direkt ersätta de skadade cellerna i hjärnan eller genom att tillföra ämnen som saknas i den skadade hjärnan med sk ex vivo genterapi, dvs efter viss behandling av cellerna in vitro. För att karaktärisera cellers potential kan de studeras i cellkultur (in vitro) och/eller efter transplantation (in vivo). I denna avhandling har vävnad och celler från både vildtyp och transgena möss använts. Stam- och progenitorceller, sk precursorer, dissekerades ut från tre specifika områden i den embryonala mushjärnan: dels de laterala och mediala ganglionära eminencerna (LGE och MGE), som tillsammans bildar striatum och delvis medverkar till bildning av interneuron i luktbulben, hjärnbarken, och hippocampus. Vi isolerade även celler från den del av hjärnan som efter utvecklingen kommer att ge upphov till största delen av hjärnbarken. Celler odlades på två olika sätt in vitro, dels som fastsittande gliakulturer i närvaro av serum ochtillväxtfaktorn EGF (epidermal growth factor) och dels som friflytande aggregat sk. neurosfärer, i närvaro av EGF och bFGF (basic fibroblast growth factor). Vi fann att dessa precursorer kan bibehållas i kultur under väldigt lång tid och att de även har möjlighet att vid ändrade växtförhållanden ge upphov till nervceller, astrocyter och oligodendrocyter. Vi kunde även visa att de nybildade nervcellerna som bildas i kulturerna, till viss del bibehöll vissa regionspecifika markörer efter expansion i kultur. Med hjälp av transgena celler visade vi vidare att några av de nyblidade nervcellerna hade genererats av GFAP-uttryckande celler, vilket betyder att GFAP-uttryckande gliaceller har viss stam-/progenitorcell kapacitet in vitro. Cellernas förmåga till integrering, migration och differentiering in vivo, studerades genom transplantation av dessa celler till vuxna och nyfödda råttor. Att transplantera celler från mus till råtta underlättar arbetet med att hitta cellerna efter transplantation, då man kan använda sig av art-specifika markörer vid detektionen. Använder man dessutom vävnad eller celler från en transgen mus kan denna transgen också användas som markör vid detektion av cellerna efter transplantation. I denna avhandling har vi använt oss av den art-specifika markören M2, och reportergenen GFP (green fluorescent protein). De fastsittande gliakulturerna från LGE transplanterades till striatum på vuxna och nyfödda råttor. Fyra veckor efter transplantation såg vi att cellerna hade överlevt och integrerats i värdhjärnan. Men trots att dessa celler uppvisade en neuronal differentieringskapacitet i kultur, fann vi nästan uteslutande celler med astrocytkaraktär efter transplantation. När celler från neurosfärskulturerna transplanterades till striatum, hippocampus och cortex på nyfödda råttor, fann vi dock att de bibehöll sin differentierings-kapacitiet även efter transplantation. Neurosfärerna gav till största del upphov till astrocyter, men även till ett signifikant antal nervceller och oligodendrocyter in vivo. De nygenererade nervcellerna från LGE neurosfärerna, uppvisade projektioncells-och interneurons-morfologi i striatum, samt interneurons-morfologi i luktbulben och hippocampus, vilket avspeglar den normala utvecklingen av stam- och progenitorceller från just LGE. Cellerna, till största del astrocyterna, uppvisade även viss migrations kapacitet efter transplantation till striatum. Dessa resultat visar att precursorceller som expanderas i kultur, speciellt neurosfärer, har förmåga att generera nervceller och gliaceller efter transplantation till nyfödda råttor, och att de dessutom kan utmogna till nervceller med rätt morfologi för den region i hjärnan som cellen transplanteras till. Till sist kan det nämnas att resultaten som presenteras i denna avhandling demonstrerar i sin helhet att celler genererade från den embryonala mushjärnan innehar kapacitet att expanderas under lång tid och dessutom utmogna till nervceller och gliaceller i kultur. Vidare även att de nygenererade nervcellerna till viss del behåller sina uttryck av regionspecifika markörer efter expansion i kultur. Vi kunde även visa att cellerna överlever efter transplantation till den nyfödda och till viss del även den vuxna råtthjärnan. Efter transplantation gav framförallt de celler som odlats som friflytande neurosfärer upphov till ett signifikant antal nervceller, astrocyter och oligodendrocyter i den nyfödda råtthjärnan. Trots den uppvisade kapaciteten av dessa celler krävs det fortsatt mycket arbete för att kunna förstå och kontrollera mekanismerna för tillväxt och differentiering av dessa precursor- celler innan forskningen kan fortsätta mot sådana mål som tex användning av liknande celler i kliniska studier.
2003
Malin Parmar: Molecular specification of expanded forebrain neural stem and progenitor cells
Supervisor: Anders Björklund
Department: Experimental Medical Science
Date of defense: September 3rd 2003
Place of defense: Segerfalksalen, Wallenberg Neurosciencecenter, Lund, Sweden
Opponent: Prof. Derek van der Kooy
Date of publication: 2003
No of pages: 160
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN: 91-628-5756-8
English summary
The molecular specification of neural precursor cells has been suggested to be a progressive process, with a transition from an early requirement for extrinsic signals to intrinsic mechanisms. Thus, the cells in the nervous system acquire distinct fates in response to extrinsic signals, which activate repertoires of transcription factors in a region and cell type specific manner. The studies in this thesis are aimed to increase our understanding as to the extent neural stem and progenitor cells maintain their regional identity during expansion in vitro. To address this issue, cells isolated from different regions of the embryonic or adult mouse and human forebrain were expanded, either as free-floating neurosphere cultures or as attached monolayer cultures. The expression of developmental control genes specific for each region was analyzed in the expanded cells, and their developmental potency was tested both after in vitro differentiation, and after transplantation in vivo. The results show that independent of culture method the expanded cells maintain many aspects of their regional identity. They express developmental control genes characteristic for their area of origin, and upon differentiation they generate neurons characteristic of that area. However, the different culture methods differentially expand specific progenitor populations within each area, and the progenitor composition in the cultures is decisive for the differentiation potential of the expanded cells. Besides its relevance for understanding basic developmental processes, the results may also have an impact on the selection of donor cells and expansion method for cells to be used in cell replacement therapies.
Swedish summary
Hjärnan är ett komplext system, som är uppbyggd av många olika sorters celler. Alla dessa celler har sitt ursprung i en speciell typ av cell, stamcellen. Neurala stamceller är omogna celler som har förmågan att genom delning både föröka sig själva genom att bilda fler stamceller, och ge upphov till de olika mogna celltyper som finns i hjärnan. Mycket av intresset för dessa celler kommer från förhoppningen om att de i framtiden ska kunna användas för att bota sjukdomar i hjärnan, såsom Parkinsons sjukdom. Eftersom stamceller har förmågan att dela sig och bli fler kan man plocka ut dem från hjärnan och odla dem i cellkultur. På så sätt ökar man antalet stamceller (expansion), som sedan kan producera nya nervceller Hur vet då den nya nevcellen vilken typ av cell den ska bli? Har stamcellerna bibehållit den information som krävs för att bilda “rätt” sorts nervcell? Det är dessa frågor som jag har försökt svara på i mitt avhandlingsarbete. För att studera detta har jag isolerat stamceller från olika områden i hjärnan och sedan expanderat dem i cellkultur. När cellerna delat sig många gånger och blivit tusentals fler, har jag studerat uttrycket av gener och proteiner som är karakteristiska för stamcellerna i ursprungsområdena. På så sätt har jag kunnat visa att de celler som delat sig utanför hjärnan är väldigt lika de celler som delat sig inne i hjärnan. Cellerna har alltså behållt ett mine av det område i hjärnan som de plockades ut från, och beroende på var de kommer ifrån ger de upphov till olika sorters nervceller.
2002
Ulrica Englund: In vivo properties of neural stem cells after transplantation into the rat brain-Studies of phenotypic differentiation and functional integration using cell-specific labelling and electrophysiological techniques
Supervisor: Anders Björklund
Department: Experimental Medical Science
Date of defense: June 8th 2002
Place of defense: Segerfalk lecture hall, Wallenberg Neuroscience Center
Opponent: Professor Peter Eriksson
Date of publication: 2002
No of pages: 184
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN: 91-628-5213-2
English summary
In the present thesis, we have examined the in vivo properties of in vitro expanded human and rat neural stem-and progenitor cells after transplantation into the neonatal and adult rat brain. The survival and differentiation of the grafted cells were assessed using species-specific antisera, and pre-labelling with the reporter gene green fluorescent protein (GFP). Long-term growth factor-expanded human progenitors successfully survived after grafting into the neonatal and adult striatum, subventricular zone (SVZ) and hippocampus. Target-directed migration, and region-specific neuronal differentiation of grafted cells were observed after transplantation into the neurogenic SVZ and hippocampus. Extensive migration of implanted cells identified as glial progenitors, occured within white matter. In the striatum and hippocampus, neuronal and glial differentiation were most pronounced at the graft core, with both neuronal and glial processes extending over long distances. A fraction of non-migratory undifferentiated cells remained at the implantation site. Neurogenic properties of the neural cell line RN33B, carrying the GFP reporter gene, were studied after grafting to the neonatal brain. Large numbers of RN33B cells differentiated into pyramidal neurons in the cortex and hippocampus, with projections to normal target regions, such as the thalamus and contralateral hippocampus, respectively, as revealed by retrograde tracing. Whole-cell patch clamp recordings of grafted cortical pyramidal neurons showed that RN33B cells develop physiological properties of mature neurons and become functionally integrated within host neural circuitry. Our data demonstrate a remarkable capacity of expandable neural precursors for different types of migration, and multipotential differentiation, along neuronal and glial lineages. Along with region-specific neuronal differentiation we observed establishment of appropriate anatomical projections, and functional integration into host circuitry. These results suggest that these cell types are highly useful for further research into the mechanisms responsible for cellular migration, differentiation and integration in the mature central nervous system.
Swedish summary
Forskning om stamceller har fått mycket uppmärksamhet de senaste åren. Mycket av intresset avspeglar möjligheten att använda denna typ av celler som en terapi för att bota olika sjukdomar. En stam cell från hjärnan är en cell som har förmåga att dela sig symmetriskt, varvid två kopior bildas eller asymmetriskt, vilket ger upphov till en ny stam cell samt en progenitorcell. En progenitorcell har ett förutbestämt öde, att utvecklas till en nervcell eller en stödjecell (gliacell), samt förmågan att dela sig under en kortare period. Stamceller som har isolerats från den embryonala och vuxna hjärnan, kan odlas i cellkultur under specifika betingelser. Egenskaperna hos de isolerade stam- och progenitorcellerna för nerv- och gliaceller (tillsammans kallade neurala celler) har studerats främst i cellodling (in vitro) och efter transplantation (in vivo), och resultaten har varit betydelsefulla för kartläggandet av neurobiologiska förlopp under utvecklingen. Då neurala stam-och progenitor celler kan mångfaldigas och modifieras i cellodling betraktas de också som en möjlig celltyp för framtida klinisk tillämpning med celltransplantation, till exempel för patienter med Parkinsons sjukdom. En eventuell användning av stamceller i denna typ av applikation kräver grundläggande experimentella försök för att dokumentera cellernas egenskaper och framförallt förmåga att funktionellt integrera med värdhjärnan efter transplantation. Mitt avhandlingsarbete handlar om karakterisering av sådana embryonala neurala stam- och progenitor celler efter transplantation till hjärnan på råtta. Ett antal olika metoder användes för att detektera cellerna efter implantationen, bland annat reporter genen Green Fluorescent Protein (GFP). I det första delarbetet optimerades metoden för inmärkning av neurala celler med reporter genen, och då primärt i syfte att uttryckas efter transplantation. Då GFP är distribuerad i hela cytoplasman, visualiseras hela morfologin av cellerna. I de två följande delarbetena beskrivs hur humana neurala cell linjer etablerade från embryonal vävnad, kan odlas som så kallade neurosfärer och expanderas upp till ett år i närvaro av mitogena tillväxtfaktorer, med bibehållen förmåga att mogna till nerv- och gliaceller. Dessa cell linjer överlever väl upp till över ett år efter transplantation till hjärnan på nyfödda och vuxna råttor. Cellerna analyserades in vivo med human-specifika generella och phenotypiska markörer, samt med hjälp av reporter genen GFP. Efter transplantation till de neurogena områden, d v s den subventrikulära zonen och hippocampus, migrerar de humana cellerna och differentierar till region-specifika neuron likt värdhjärnans nervcells-progenitorer. Efter implantation i det icke-neurogena striatum migrerar cellerna, identifierade som gliaprogenitorer, över långa distanser i vit vävnad. I striatum utvecklades en signifikant del av de transplanterade cellerna till nervceller, med projicerar till korrekta målområden. En del av de transplanterade humana cellerna mognade till astrocyter och oligodendrocyter, vilket innebär att de humana celllinjerna är multipotenta även in vivo. GFP-positiva nervceller hade morfologiska egenskaper som är karakteristiska för mogna nervceller, såsom rikt förgrenade dendriter med spines. Trots kapacitet att migrera och differentiera till nerv och- gliaceller efter transplantation, kvarstår frågan till vilken grad de humana progenitorerna kan integrera funktionellt med värdhjärnan. I de två sista delarbetena studerades den immortaliserade neurala cellinjen RN33B, som är genererad från embryonala hjärnstamsceller i råtta. Den temperaturkänsliga immortaliseringsgenen gör att cellerna delar sig vid 33°C i cell odling, men vid 37°C mognar cellerna och då främst till nervceller in vitro. RN33B- cellerna märktes med reporter genen GFP (se ovan) in vitro, och sedan studerades cellernas kapacitet att utvecklas till regionspecifika nervceller samt att integrera funktionellt med värdhjärnan studerades morfologiskt efter transplantation till hjärnan på nyfödda råttor. RN33B cellerna överlevde väl upp till 4 månader efter transplantationen och bildade både nervceller och gliaceller. Vidare visade den morfologiska analysen att RN33B-cellerna har en exceptionell förmåga att bilda pyramidala nervceller i cortex och hippocampus, med projektioner till korrekta målområden. Projektionerna studerades genom injektioner av Fluorogold (FG), som transporteras från projektionerna i målområdet till cellkroppen. Slutligen visade vi, med hjälp av så kallad patch-clamp teknik, att transplanterade GFP-positiva RN33B pyramidceller i cortex har normala elektrofysiologiska egenskaper samt tar emot information från omkringliggande celler i värdhjärnan. Sammanfattningsvis visar studierna i denna avhandling att neurala stamceller överlever transplantation, och utmognar till nerv- och gliaceller. Vidare så utvecklade nervcellerna projektioner som nådde till korrekta målområden, samt integrerade funktionellt med värdhjärnan. Dessa egenskaper i kombination med möjligheten att mångfaldiga de neurala celltyperna in vitro är mycket intressanta för fortsatta studier rörande funktionell integration efter transplantation och utveckling av celler för transplantation i djurmodeller av neurodegenerativa sjukdomar.
2002
Christian Winkler: Toward a restorative therapy for Parkinson´s disease. Studies on the functional efficacy of intracerebral fetal cell transplants and GDNF delivery
Supervisor: Anders Björklund
Department: Experimental Medical Science
Date of defense: October 5th, 2002
Place of defense: Segerfalksalen, Wallenberg Neuroscience Center
Opponent: Professor Jeffrey H. Kordower
Date of publication: 2002
No of pages: 160
Type of document: PhD Thesis
Language: Engelska
ISBN: 91-628-5358-9
Summary
Parkinson´s disease is characterized by a progressive degeneration of the nigral dopaminergic system. Treatment of disease symptoms using L-DOPA frequently induces side effects such as L-DOPA-induced dyskinesia. New therapeutic approaches are aimed at preventing neurodegeneration or restoring the dopaminergic system by fetal dopaminergic transplants. In this thesis work, we evaluated the neuroprotective capacity of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in the rat Parkinson model. Delayed short-term treatment with glial cell line-derived neurotrophic factor provided long-term rescue of nigral dopaminergic neurons. Nigral administration of GDNF, however, did not prevent the dopaminergic fibre loss in the striatum, and thus, functional recovery was not obtained. We also evaluated the functional efficacy of fetal transplants in the rat Parkinson model. Multiple intrastriatal microtransplants of fetal dopaminergic cells induced pronounced functional improvements. Complete normalization of all cellular and behavioural parameters, however, was not obtained which may be due to the ectopic transplant location. Mulitple intranigral transplants of fetal dopaminergic or fetal GABA-rich striatal tissue also induced improvements of lesion-induced deficits, which are proposed to be due to local intranigral mechanisms. We also characterized a rat model of L-DOPA-induced dyskinesia to show that incidence of dyskinesia, latency to develop dyskinesia, and expression of dyskinesia subtypes depends on the magnitude of striatal dopaminergic denervation. The findings of this thesis have implications for the development of effective new therapies for Parkinson´s disease.
2001
Deniz Kirik: Restorative and neuroprotective treatment strategies for Parkinson’s disease: Studies on fetal dopamine cell transplants and GDNF delivery by intracerebral injections and recombinant AAV vectors
Supervisor: Anders Björklund
Department: Experimental Medical Science
Date of Defense: March 16th, 2001
Place of defense: Segerfalk room, Wallenberg Neurocenter, Lund
Opponenet: Prof Stephen B. Dunnett
Date of publication: 2001
No of pages: 172
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN: 91-628-4679-5
Summary
The intrastriatal 6-hydroxydopamine lesion model in rats is particularly useful in studies testing new therapeutic strategies for Parkinson’s disease. This thesis work (1) describes the characterization of the motor deficits after different types of intrastriatal lesions and identifies the four-site terminal lesion as a model of symptomatic Parkinson’s disease; (2) using the same model, provides evidence that the functional impact of the dopamine cell grafts are dependent on interactions with the host brain; (3) demonstrates that protection or restitution of normal motor function after 6-hydroxydopamine lesions can be achieved if glial cell line-derived neurotrophic factor is administered in the striatum at the time of the terminal fiber degeneration. The findings have implications for the development of effective neuroprotective and restorative therapeutic interventions for Parkinson’s disease.
1999
Carl Rosenblad: Neuroprotective and regenerative actions of GDNF and neurturin on nigral dopamine neurons in rat models of Parkinson’s disease – Prospects for clinical use of neurotrophic factors in neurodegenerative disorders
Supervisor: Anders Björklund
Department: Experimental Medical Science
Date of defense: June 5th, 1999
Place of defense: Segerfalksalen, Wallenberg Neuroscience Center
Opponenet: Professor Lars Olson
Date of publication: 1999
No of pages: 144
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN: 91-628-3518-1 / ISRN: LUMEDW/MEFN--1025--SE
English summary
Parkinson’s disease is characterized by progressive degeneration of the nigrostriatal dopamine system, which results in tremor, rigidity, akinesia and postural abnormalities. New therapeutic strategies are aimed at halting the neurodegenerative process or restoring the system by transplantation of fetal dopamine neurons. We have investigated the potential of the neurotrophic factors glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and neurturin (NTN) to (1) protect nigral dopamine neurons and induce functional recovery in adult lesioned dopamine neurons and (2) enhance survival, fiber outgrowth and function of transplanted fetal dopamine neurons. Intrastriatal administration of the dopamine neuron specific toxin 6-hydroxydopamine results in a progressive and partial degeneration of the nigrostriatal dopaminergic system (similar to Parkinson’s disease), which render it suitable for studies of neuroprotection, regeneration and functional recovery. GDNF, was able to completely or near-completely protect the nigral dopamine neurons when given over the substantia nigra, into the striatum or intracerebroventricularly (ICV) early after the 6-hydroxydopamine lesion. We also observed that the retraction of nigrostriatal fibers was partially prevented by GDNF administered into the striatum or ICV. The effect of NTN was more moderate with partial protection after intrastriatal injections while ICV administration was uneffective. GDNF was also able to induce regeneration of DA fibers in the striatum and the globus pallidus after intrastriatal injections but the site and magnitude of this response was variable. The lesion produced deficits in both spontaneous and drug-induced behavioral tests. Functional recovery could be obtained by intrastriatal GDNF administration but only when the striatal dopamine innervation was increased. Thus GDNF and NTN are potent neurotrophic factors for the lesioned nigrostriatal dopamine neurons. Sustained administration of GDNF and NTN to fetal dopamine neurons grafted to the striatum of rats with complete unilateral 6-hydroxydopamine lesions, resulted in a marked 1.6-1.9-fold increase in the number of surviving dopamine neurons. GDNF was also found to enhance the fiber outgrowth and function of the transplant. The results indicate that addition of these neurotrophic factors can improve the efficacy of fetal dopamine neurons transplants in patients with Parkinson’s disease.
Swedish summary
Tillväxtfaktorer kan förbättra cellöverlevnad och funktion i djurmodeller av Parkinson’s sjukdom. En av de vanligaste sjukdomarna i nervsystemet är Parkinson’s sjukdom. Den uppkommer genom att man gradvis förlorar en viss grupp av nervceller som använder signalsubstansen dopamin, vilket i sin tur leder till brist på dopamin i målområdet i hjärnan, striatum. Detta resulterar i karaktäristiska rörelse-symtom såsom skakningar, stelhet och rörelsefattigdom. Den huvudsakliga behandlingen idag, går ut på att kompensera dopaminbristen genom tillförsel av ett dopamin-liknande ämne, l-dopa, som sedan omvandlas till dopamin i hjärnan. Detta förhindrar dock inte den fortsatta förlusten av de dopamin-producerande nervcellerna. Nya behandlingstrategier riktas därför mot att ersätta den förlorade dopamin-produktionen genom transplantation av friska dopamin-nervceller till målområdet, eller att bryta sjukdomsprocessen på ett tidigt stadium innan symtomen förvärras. Metoden med transplantation av nervceller har visat bra behandlingsresultat hos patienter med Parkinson’s sjukdom, men begränsas kraftigt av att överlevnadsgraden hos transplanterade celler är låg. Ämnen som förbättrar överlevnaden och funktion hos transplantaten skulle därför göra metoden mer användbar. Arbetet med att finna sätt att bryta sjukdomsprocessen har ännu inte fått fäste i klinisk praxis kanske framför allt beroende på att inte har funnits ämnen som varit riktigt lämliga kandidater, men också på grund av svårigheter att på ett säkert sätt tillföra dessa till hjärnan under en längre tid. Så kallade tillväxtfaktorer, vilka är kroppsegna ämnen som svarar för att upprätthålla en rad olika funktioner bland annat hos nervceller, har visat sig kunna förhindra celldöd och förbättra funktionen hos dessa efter olika typer av skador. Två nyligen upptäckta tillväxtfaktorer, GDNF och neurturin, har i cellodling visat sig kunna förbättra överlevnaden och funktionen just hos de dopamin-producerande nervcellerna. Mot denna bakgrund har syftet med min avhandling varit att i försöksmodeller av Parkinson’s sjukdom hos råtta studera: 1. Om tillförsel av GDNF och neurturin kan förhidra celldöd hos dopamin-nervceller i djurmodeller av Parkinson’s sjukdom. 2. Om GDNF och neurturin kan stimulera återväxt av nya nervfibrer i det skadade målområdet. 3. Om man med hjälp av tillväxtfaktorerna kan återfå funktion i dopamincellerna så att man förbättrar den av skadan nedsatta rörelseförmågan. 4. Om man genom att injecera GDNF eller neurturin under en tid efter transplantation av nya nervceller kan förbättra överlevnaden och funktionen hos transplantaten. Eftersom djur inte naturligt drabbas av Parkinson’s sjukdom har vi använt en försöksmodell där ett specifikt cellgift, 6-hydroxydopamin, som pga sina egenskaper selektivt tas upp i dopamin-neuron och skadar/dödar dessa, injecerats i målområdet. Detta leder sedan till en utdragen förlust av dopamin-celler (som vid Parkinson’s sjukdom) och nedsatt rörelseförmåga som kan mätas i olika tester. Vi fann att GDNF kan blockera 90-100% av förlusten av dopamin-neuron om det ges vid upprepade tillfällen med början efter 6-hydroxydopamin skadan. Ges endast en injektion skyddar man fortfarande en del dopamin-celler men inte i samma utsträckning som med flera injektioner. Detta betyder att man kan behöva ge substansen under en längre tid eftersom sjukdomsförloppet vid Parkinson’s sjukdom är utdraget. Neurturin kunde också skydda de skadade nerv-cellerna men inte i samma utsträckning som GDNF. Om GDNF injecerades i målområdet under en period efter att skadan utvecklats, så fann vi återväxt av nya nervtrådar till det skadade området och detta resulterade i att GDNF-behandlade djur hade nomaliserad rörelseförmåga. Däremot var återväxten av fibrer endast marginell om skadan var mer utbredd och vi såg då heller ingen förbättrad rörelseförmåga. Detta tyder på att man kan få återväxt av nya nervtrådar, troligen från både skadade och kvarvarande intakta nervceller, men att denna är otillräcklig om det finns för lite dopamin-fibrer kvar i målområdet och från vilka nervtrådar kan växa ut. Vi har sålunda experimentellt kunnat visa att GDNF och neurturin är mycket kraftfulla faktorer för att motverka celldöd och funktionsförluster i en modell av Parkinson’s sjukdom. Friska dopamin-neuron från foster visade sig överleva betydligt bättre om de tillfördes GDNF eller neurturin under den närmsta tiden efter transplantationen. Dessutom fann vi en bättre fiberutväxt och funktion hos GDNF-behandlade transplantat. Det som är särskillt uppmuntrande med våra resultat är att överlevnaden är förbättrad utöver det som har visats för goda transplantat utan tillsatser av överlevnadsfaktorer. Våra resultat visar att användandet av GDNF eller neurturin påtagligt kan förbättra effekten av transplantation av dopamin-celler till patienter med Parkinson’s sjukdom. Det kan också ge möjlighet för fler transplantationer eftersom man kan minska mängden vävnad som behövs per transplantation.
1997
Martin Olsson: Phenotypic Specification of Striatal Progenitors; Evidence for both cell-autonomous and environmental control as studied by transplantation into the adult and developing rodent brain
Supervisor: Anders Björklund
Department: Experimental Medical Science
Date of defense: September 12th, 1997
Place of defense: Segerfalksalen, Wallenberg Neuroscience Center, Lund
Opponent: Dr Gord Fishell
Date of publication: 1997
No of pages: 208
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN: 91-628-2613-1 / ISRN: LUMEDW/MEFN-11-SE
Summary
The striatum is the major component of the ventral telencephalon and basal ganglia, involved in the processing of cortical information. The vast majority of the neuronal population in the striatum are striatal projection neurons, with connection to the globus pallidus and substantia nigra. The remaining striatal population consists largely of cholinergic, parvalbumin or somatostatin-containing interneurons. The striatum is thought to develop from two transient elevations arising in the ventral telencephalon at midgestation, the lateral and medial ganglionic eminence. The studies in this thesis are aimed at localizing the specific progenitors for striatal neuronal subtypes and identifying the developmental mechanisms utilized by the embryonic brain for proper differentiation of these distinct neurons. These questions were addressed by transplanting neural progenitors into brains, ranging from adult to early embryonic stages. Striatal projection neurons were observed to be generated predominantly from progenitors in the lateral ganglionic eminence. Progenitors in this structure were also found to generate somatostatin neurons. In contrast, cholinergic and ventral telencephalic parvalbumin-containing neurons were found to be generated from the early stage medial ganglionic eminence. In addition, thyroid transcription factor-1 was observed to define the early stage medial ganglionic eminence and this protein was also detected in cholinergic and parvalbumin expressing cells from early differentiation till adulthood. Progenitors differentiating into distinct neuronal subtypes were found to be specified at an early stage in the generation of the distinct subtypes, respectively. These progenitors displayed specification in terms of neurochemical expression, axonal outgrowth and migration. This specification appeared to be cell-autonomous and maintained through a number of cell divisions since heterotopic transplantation into both the adult and neonatal brain environment was unable to alter their specified fate. However, environmental signaling could respecify many ventral telencephalic progenitors following heterotopic transplantation into the embryonic brain, thus revealing a broad developmental potential of this population. These results demonstrate that specific progenitors within the lateral and medial ganglionic eminences contribute to distinct neuronal subtypes. These progenitors are specified early by cell-autonomous mechanisms which direct differentiation into distinct neuronal identities. However, these neural progenitors can be respecified under the influence of environmental signaling present in the neurogenic embryonic brain. Thus, cell fate determination during ventral telencephalic development appears to invlove both cell-autonomous and local inductive mechanisms.
1996
Giampiero Leanza: Anatomical, neurochemical and behavioural consequences of immunotoxin lesions of the basal forebrain cholinergic system
Author: Giampiero Leanza
Supervisor: Anders Björklund
Department: Experimental Medical Science
Date of defense: June 14th, 1996
Place of defense: Segerfalkssalen, Wallenberg Neuroscience Center
Opponent: Prof Jon Storm-Mathisen
Date of publication: 1996
No of pages: 52
Type of document: PhD Thesis
Language: Engelska
ISBN: 91-628-2075-3 / ISRN: LUMED/MEAH.1028-SE
Summary
The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction suggests that the learning and memory deficits representing the cardinal symptoms of dementia in the aged and in patients suffering from Alzheimer's disease may be attributable to a decline in the function of the cholinergic projection systems of the basal forebrain. Although many studies have addressed the issue of a causal relationship between cholinergic hypofunction and cognitive disturbance, analyses of the functional role of the basal forebrain cholinergic neuronal systems in the brain have so far been hampered by the lack of an efficient and specific cholinergic neurotoxin. The recent introduction of a novel toxin conjugate, 192 IgG-saporin, able to selectively target and efficiently lesion cholinergic neurons in the basal forebrain has provided an opportunity, not previously available, for a more direct evaluation of the assumptions stated in the original formulation of the cholinergic hypothesis. In present series of experiments, the effects and the selectivity of the 192 IgG-saporin immunotoxin on a variety of anatomical, biochemical and behavioural measures were investigated following intraventricular injections to neonatal and adult rats. Also, the same immunotoxin lesion model has been employed in neonatal and adult rats to explore respectively the functional integration and reinnervation capacity of embryonic septal grafts homotopically grafted into the neuron-depleted septum, as well as to investigate the ability of cholinergic-rich grafts, placed combinedly into the depleted hippocampus and cortex, to ameliorate the functional deficits induced by the immunotoxin treatment.The results show that severe learning and memory impairments, associated with a near total (“95%) loss of basal forebrain cholinergic neurons, can be induced in adult animals following intraventricular administration of the toxin conjugate, and that these effects are highly specific and of a magnitude higher than that reported for previous lesioning techniques producing less severe deficits. By contrast, none of the observed functional deficits were evident following neonatal immunotoxin lesions leaving substantial cholinergic neuronal sparing, but they manifested dramatically when the activity in the residual cholinergic neurons was either pharmacologically blocked or permanently disrupted by a second lesion. This suggests: (a) that a subthreshold (i.e. ¾80-85%) cholinergic loss may not suffice for functional deficits to become apparent, and (b) that compensatory changes and/or a higher degree of plasticity in the developing as compared to the mature cholinergic system may efficiently sustain functional sparing for extended periods after the lesion. The results of the transplantation studies show: in neonatal hosts, that cholinergic neuroblasts implanted into the neuron-depleted septum can survive, integrate and extend axons along major myelinated pathways which reinnervate the appropriate target territories; in adult hosts, that intrahippocampal and intracortical grafts of cholinergic tissue can efficiently reverse the severe functional deficits induced by a previous immunotoxin lesion. Taken together, these data therefore support the hypothesis for an important involvement of the basal forebrain cholinergic projection system in cognitive functions.
1996
Cecilia Lundberg: Use of neural progenitor cell lines and astrocytes for transplantation and gene transfer to the CNS
Author: Cecilia Lundberg
Supervisor: Anders Björklund
Department: Experimental Medical Science
Date of defense: June 8th, 1996
Place of defense: Segefalkssalen, Wallenberg Neuroscience Center, Lund
Oppononent: Dr Clive N. Svendsen
Date of publication: 1996
No of pages: 143
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN: 91-628-2096-6 / ISRN: LUMED/MEAH.1027-SE
English summary
Intracerebral neuronal transplantation have been shown to ameliorate symptoms of brain dysfunction in both animals models and Parkinson's disease, although problems still remain. The newly introduced technique of ex vivo gene transfer could serve as an alternative approach, possible avoiding some of the draw-backs of the embryonal tissue used in neuronal grafting. We have investigated the feasiblilty of primary astrocytes and conditionally immortalized neural progeintor cell lines as transgene-carriers. The results show that these cell types survive well after transplantation, without apparent tumor formation or tissue perturbation, over extended periods of time. All cell types studied here were shown to be well accepted by the host, to migrate away from the injection site and become integrated in the surrounding host tissue. The transplanted neural progenitor cell lines were found to respond to lesion-activated signals form the host brain in a manner similar to the resident glial population, strongly suggesting that the grafted progenitors are able to integrate both anatomically and physiologically with the host CNS. A proportion (almost 50%) of the undifferentiated immortalized cell lines were found to differentiate into mature phenotypes after grafting to the adult rat brain. The vast majority of the grafted cells presented glial-like morphologies after grafting into the adult rat striatum. However, the brain stem-derived RN33B, differentiated into substantial numbers of neurons in a highly target-specific manner. The results thus indicate, firstly, that the immortalized neural progenitor cell lines possess the capacity to differentiate adequately in response to host-derived signals and, secondly, that the adult brain expresses the cues needed to induce such differentiation. The experiments performed to analyze the functional efficacy of primary astrocytes and immortalized neural progenitor cell lines as transgene carriers revealed that this mode of gene transfer holds great potential. Transduction of either a neurotransmitter-producing enzyme (TH) or a neurotrophic factor (NGF) resulted in functional effects in the models used. These results indicate that ex vivo gene therapy in the brain is possible and that neural cells, used a vehicles for the transgenes, would be feasible in this context. The results of the present thesis serve as a good basis for the design of future experiments regarding the search of differentiating signals retained by the adult brain, as well as further development of ex vivo gene transfer to the brain towards clinical applications.
Swedish summary
Transplantation av nervvävnad till hjärnan är inte en ny idé. Redan 1890, publiserade Thompson de första försöken att transplantera vuxen hjärnvävnad till det vuxna centrala nervsystemet och han rapporterade att vävnaden överlevde i sju veckor "without wholly losing its identity". Trots detta var det först under 1970-talet som metoderna för intracerebral nervcellstransplantation utvecklades och uppflöjande experiment på funktionen av dessa transplantat kunde göras i olika djurmodeller för störd hjärnfunktion. Dessa experiment ligger till grund för de nyligen genomförda kliniska försök där embryonal substantia nigra transplanterats till striatum på patienter med Parkinsons sjukdom med lovande resultat. Användadet av embryonal vävnad i klinisk praktik är dock inte helt problemfri. Det finns t ex risk för överföring av infektioner från donator till motagare, tekniska problem såsom dålig överlevnad av de transplanterade cellerna, och sist men inte minst etiska aspekter att ta hänsyn till. Utvecklingen av rekombinant DNA teknik har utmålats som en väg att dramatiskt förbättra medicinsk terapi, genom sk genterapi. Möjligheten att påverka genuttrycket i celler med onormal funktion och på så sätt mildra sjukdomssymtomen, inger ett stort hopp om effektiv behandling av många förödande tillstånd. Föreslagna applikationer i hjärnan är t ex medfödda fel i cellens ämnesomsättning, hjärntumörer, slaganfall och neurodegenerativa sjukdomar. I den föreliggande avhandlingen kombineras de två applikationerna, transplantation till hjärnan och genöverföring, och vi har undersökt dels hur de transplanterade cellerna beter sig efter transplantation till hjärnan och dels om vi kunde mildra symtomen i två olika djurmodeller av neurodegenerativa processer i centrala nervsystemet. Som alternativ till diffrentierade nervceller har vi undersökt, dels gliaceller, dels cellinjer från embryonal hjärnvävnad. Cellinjerna är av sk temperaturkänslig typ, vilket betyder att de delar sig vid 33°C men slutar proliferera och påbörjar sin diffrentiering vid 37-38°C. Alla olika celltyper som vi undersökt i detta arbete visade sig kunna integrera väl med värdhjärnan efter transplantation till vuxna råttors striatum. De migrerade upp till 1.5 mm ut från injektionsstället, och spred sig ut över hela striatum. Deras antal steg initialt till ungefär det dubbla, men var sedan i princip stabilt i upp till 6 månader efter transplantationen, utan att tumörväxt kunde detekteras i något fall. Majoriteten av de transplanterade cellinjerna uppvisade glia-lik morfologi, och i oskadad striatum uttryckte ca 10-15% av cellerna glia-specifikt protein. Ultrastrukturellt visade cellerna upp morfologier som var identiska med normalt förekommande gliaceller i hjärnan. När vi aktiverade gliapopulationen i striatum svarade de transplanterade cellinjerna adekvat på skade.inducerade signaler från värdhjärnan. Detta resultat talar för att cellerna inta bara är integrerade morfologiskt, utan även funktionellt i värdvävnaden. På så sätt har de transplanterade cellerna möjlighet att delta i de normala funktioner gliaceller utövar i hjärnan. Andelen celler som antog nervcells-fenotyp var i de flesta fall mycket liten, förutom efter transplantation av den hjärnstams-deriverade cellinjen RN33B. Denna cellinje genererade upp till 15% nervceller. Dessa celler uttryckte inte bara allmäna neuron-specifika protein, utan också protein specifika för striatala projektionsneuron samt etablerade kontakt med globus pallidus, ett av de målområden som normalt innerveras av striatum. Sammantaget visar resultaten att denna typ av celler har många av de egenskaper som krävs för att effektivt kunna införa nya eller förlorade genprodukter till hjärnan med hjälp av genterapi. I försöken med genöverföring var cellerna effektiva i råttmodellen för Parkinsons sjukdom, där gliaceller var modifierade att uttrycka tyrosinhydroxylas och på så sätt producera DOPA, prekursorn till dopamin. Den funktionella effekten mättes i from av minskad motorisk assymetri hos den transplanterade råttan vid dopamin-agonist stimulering. NGF-producerande temperatur-känsliga celler visade sig kunna helt motverka den celldöd som kolinerga nervceller i mediala septum genomgår när deras axoner skärs av. Denna NGF-effekt har visats tidigare i experiment där NGF har infunderats i hjärnans ventrikel system, men dosen NGF som behövdes för samma effekt var betydligt lägre, kanske bara en 10-del, när de NGF-uttryckande cellerna användes. Sammanfattningsvis visar resultaten att det är möjligt att påverka hjärnans funktion med transplanterade celler av glia-typ som ektopiskt uttrycker specifika, funktionella protein. Dessa fynd torde kunna ligga till grund för utvecklingen av kliniska applikationer, men det är viktigt att betona att de försök som gjorts hittills representerar de initiala stegen mot en sådan användning. Mycket arbete kvarstår för att få kunskap om de optimala förfaringssätten i en klinisk situation.
1995
Hansjörg Sauer: Dopamine cell survival and neurotropic factor action in the basal ganglia of the rat
Author: Hansjörg Sauer
Supervisor: Anders Björklund
Department: Histology
Date of defense: June 15th, 1995
Place of defense: Dept of Histology
Opponent: Prof. Jens Zimmer, Århus, Denmark
Date of publication: 1995
No of pages: 75
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN: 91-628-1648-5
1994
Kenneth Campbell: Internal organization and functional regulation of intrastriatal striatal transplants
Author: Kenneth Campbell
Supervisor: Anders Björklund
Department: Histology
Date of defense: October 8th, 1994
Place of defense: Dept of Histology
Opponent: Prof. Charles Gerfen, Bethesda, USA
Date of publication: 1994
No of pages:
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN: 91-628-1391-9
1994
Guido Nikkhah: Microtransplantation of nigral dopamine neurons in a rat model of Parkinson's disease
Author: Guido Nikkhah
Supervisor: Anders Björklund
Department: Histology
Date of defense: December 3rd, 1994
Place of defense: Dept of Histology
Opponent: Prof. Stephen B. Dunnett, Cambridge, UK
Date of publication: 1994
No of pages: 208
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN: 91-628-1439-7
1993
Maria Angela Cenci-Nilsson: Regulation of brain stem serotonergic and noradrenergic systems
Author: Maria Angela Cenci-Nilsson
Supervisor: Anders Björklund
Department: Histology
Date of defense: September 23rd, 1993
Place of defense: Dept of Histology
Opponenet: Prof Patrick Aebischer, Lausanne, Switzerland
Date of publication: 1993
No of pages: 82
Type of document: PhD Thesis
Language: English
ISBN: 91-628-0995-4
1991
Walter Fischer: Nerve Growth Factor: Amelioration Degenreative Changes in Cholinergic Neurons of the Brain
1990
Klas Wictorin: Integration of Striatal Transplants with the Damaged Host Brain
1990
Ola G. Nilsson: Growth and Function of Cholinergic Neurons Transplanted to the Hippocampus
1988
Peter Kalén: Regulation of Brain Stem Serotonergic and Noradrenergic Systems
Patrik Brundin: Towards a Transplantation Therapy for Parkinson's Disease
1987
Ole Isacson: Neural Granfing in an Animal Model of Huntington's Disease
1984
Gunnar Skagerberg: Anatomy of Central Dopaminergic and Serotonergic Systems
1981
Ingemar Lorén: Metal Ions in Monoamine Fluoresence Histochemistry
1980
Leif Wiklund: Studies on Anatomical, Functional and Plastic Properties of Central Serotoninergic Neurons
1979
Kjeld Møllgård: Serotoninergic Regulation of Secretory Activity of the Subcommissural Organ in some Rodents
1975
Niels-Aage Svendgaard: Morphology and Function of Regenerating Monoaminergic and Cholinergic Neurons
1974
Bo Bjerre: A Possible Role of Nerve Growth Factor During Neural Differentiation and During Regeneration of Central and Peripheral Noradrenergic Neurons
1974
Olle Lindvall :The Glyoxylic Acid Fluorescence Histochemical Method for Monoamines
1973
Hans Georg Baumgarten: The Effect of Various Hydroxylated Tryptamnies on CNS Monoamine - Containing Neurons in the Rat
1973
Anders Nobin: Experimental Studies on the Organization of Monoamine Neurons in the Central Nevous System
1971
Ulf Stenevi: Sprouting and Plasticity of Central Monoamine Neurons with Microspectrofluorometric Characterization of their Intraneuronal Fluorophores